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學習下雙門層析實驗冷柜的操作步驟
發布時間:2019-11-14   點擊次數:26次
   雙門層析實驗冷柜是“色層分析”的簡稱。利用各組分物理性質的不同,將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用于有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。
 
  雙門層析實驗冷柜利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例,達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有的分辨力。
 
  雙門層析實驗冷柜法的操作步驟:
 
  1、裝柱:分配柱層析的裝柱比吸附柱層析麻煩一些,但十分重要,直接影響分離效果。裝柱前,將固定相與載體混合,如果用硅膠、纖維素等載體時,可以直接稱出一定量固體,再加入一定比例的固定相液體,混勻后按吸附劑裝柱法裝入。裝柱也分干法和濕法兩種。應注意的是:因為分配柱層析法使用兩種溶劑,所以事先必須先使這兩個相互相飽和,即將兩相溶劑放在一起振搖,待分層后再分別取出應用。至少流動相應先用固定相飽和后再使用;否則,在以后洗脫時當通過大量的流動相時,就會把載體中的固定相逐漸溶掉.后只剩下載體,就不成為分配色譜了。用硅藻土為載體,加固定相直接混合的辦法不容易得到均勻的混合物。為此先把硅藻土放在大量流動相液體中,在不斷攪拌下,逐漸加入固定相,加時不宜太快,加完后繼續攪拌片刻。有時因局部吸著水分(固定相)過多,硅藻土會聚成大塊,可用玻璃棒把它打散.使硅藻土顆粒均勻,然后填充柱管,分批小量地倒入柱中,用一端是平盤的棒把硅藻土壓緊壓平,隨時把過多的溶劑放出。待全部裝完后,應得到一個均勻填好的層析柱。流動相通過時的流速與硅藻土所含的水分和固定相有關,水分太多時流動困難。一般每克硅藻土多可以吸著2-3ml水溶液,再多時流動相就不容易通過。
 
  反相分配柱層析中多用纖維素粉末為支持劑,與固定相混合方法按一般操作。通常是將選好的固定相溶劑與載體拌勻,在布氏漏斗上抽濾除去多余的固定相后,倒入事先選定的流動相溶劑中,劇烈攪拌使兩相互相飽和平衡,然后在層析管中加入已用固定相飽和的流動相,按一般濕法裝柱。
 
  2、加樣
 
  ①如樣品能溶于流動相,可用少量流動相溶解,用吸管輕輕沿管壁加于含固定相載體的上端,然后加流動相洗脫;②如樣品難溶于流動相,易溶于固定相,則可用少量固定相溶解,加少量載體拌勻吸著后裝于柱管頂端載體的上端,然后加流動相洗脫;③如樣品在兩相中都不易溶解,則可用其他揮發性溶劑溶解后,拌入干燥的載體,待溶劑揮發除盡后,加適量(樣品量的50%-100%)的固定相拌勻,加入柱頂。樣品量與載體重量之比為1∶100—1∶1000。
 
  3、洗脫
 
  用流動相洗脫的方法與吸附層析法相同。但有一點須注意,流動相溶劑在使用前也應以固定相液予以飽和,否則層析過程中固定相的體積會發生變化,平衡條件就被破壞,影響分離效果。
 

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